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慢病毒包装


慢病毒(Lentivirus/Lv)属于逆转录virus科,名称源自该种virus长达数年的潜伏期,其中较为人所知的是人类免疫缺陷virus(HIV-1)。HIV-1 直径约 120nm,含两条正链 RNA,可有效的进入细胞核中,对分裂期细胞及非分裂期细胞均具有很高的感染效率。慢病毒感染细胞后可将所携带的基因整合到细胞基因组中,并且长时间持续稳定表达,同时能够随细胞分裂稳定遗传下去,因此成为导入外源基因的有效工具。

慢病毒载体是以 HIV-1 为基础改造获得的基因治疗载体,通过去除致病基因,同时减少辅助质粒与载体质粒的同 源性,使慢病毒具有了滴度更高、生物安全性更好、导入外源片段的能力更强等特性。目前慢病毒系统已经广泛应用到基因过表达、RNA 干扰、miRNA 研究及基因敲除等功能研究的细胞实验和动物实验中。



慢病毒包装流程


慢病毒的 MOI 预实验步骤(以 96 孔板为例):


1、第一天:铺板
在 96 孔板中按每孔约 1x10 4 个细胞接种。
注:如果细胞特别大可以适当减少,特别小可以增加,原则上以第二天,汇合度达到 30%~40%为宜。
2、第二天:感染
2.1设计 MOI 梯度实验组
     1) MOI 依次设置为: 0、1、10、20、50、100。
     2) 同时设置加含 8 ug/ml(参考示例) Polybrene 的培养基实验组。
     3) Blank 组即空细胞组,作为参照,以检验细照生长状态。
2.2计算病毒量:
每孔加病毒量(ul)=MOI x 感染时的细胞数/滴度(TU/ml)×1000
注:一般第二天细胞数按倍增来算,生长较慢或不增殖的细胞可适当调整。
例如:病毒滴度 1×10 8 TU/ml,接种细胞数 1×10 4 ,那么 MOI 为 10 的组中病毒量=10×2×1×10 4 /(1×10 8 )×1000=2ul,依次类推。
2.3. 加慢病毒
按照计算好的量将病毒液分别加入培养基中,混匀,继续培养。
注:如果遇到病毒滴度太高,每孔加的病毒太少,移液器量程不够等情况,可以先将病毒稀释后再加。
3. 第三天:换液
感染后 12-24 小时,将各实验组更换为新鲜培养基,继续培养。
4. 第五天:确定合适的 MOI 值
1) 感染后 72 小时在荧光显微镜下观察,并拍照。
2) 确定合适的 MOI 值。



慢病毒优势
1、感染范围广
慢病毒可有效感染分裂和非分裂细胞,适合几乎所有细胞系,如神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等。
2、表达时间长
慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上,实现基因长时间稳定的表达,不随细胞分裂传代而丢失,常用于构建稳定株,是细胞实验的较优选择。



普通真核质粒 病毒 腺病毒 腺相关病毒
基因组 dsDNA dsRNA dsDNA ssDNA
外源基因装载量
大于10kb 小于4kb 小于5kb 小于2.5kb
因组整合 随机低频整合 机高频整合 非整合 低频定向整合
表达起始时间(细胞)
1-2天 3-4天 1-2天 1-2天
表达起始时间(动物)
-- 1周 2-4天 2-4周
表达持续时间
1周左右 整合后持续表达 2周左右 3-6个月
免疫原性
低免疫原性 低免疫原性 高免疫原性 低免疫原性


客户发表文章(部分):

1、Characterization of novel LncRNA P14AS as a protector of ANRIL through AUF1 binding in human cells. 2020 ,  Molecular Cancer  (IF=27.401) . 合生产品:质粒载体/慢病毒包装试剂盒 ,北京大学肿瘤医院

2、A microbiota-derived bacteriocin targets the host to confer diarrhea resistance in early-weaned piglets. 2018 ,  Cell Host & Microbe(IF=20.56). 合生产品:Cas9基因敲除质粒, 华中农业大学

3、Gasdermin E–mediated target cell pyroptosis by CAR T cells triggers cytokine release syndrome. 2020 ,  Science Immunology(IF=17.448). 合生产品:过表达质粒, 中国医学科学院北京协和医院

4、YTHDF2 facilitates UBXN1 mRNA decay by recognizing METTL3-mediated m6A modification to activate NF-κB and promote the malignant progression of glioma. 2021 , Journal of Hematology & Oncology (IF=17.388). 合生产品:干扰慢病毒

5、Improved sgRNA design in bacteria via genome-wide activity profiling. 2018,Nucleic Acids Research(IF=16.971). 合生产品: CRISPR/Cas9个性化转录抑制文库,清华大学

6、Pooled CRISPR interference screening enables genome-scale functional genomics study in bacteria with superior performance. 2018 , Nature Communications(IF=14.919). 合生产品: CRISPR/dCas9个性化转录抑制文库清华大学



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