IP-MS（免疫沉淀质谱联用）

       基于无标记蛋白质组学技术，鉴定与目的蛋白相互作用的蛋白质。采用免疫共沉淀方法，以目的蛋白为诱饵，将目的蛋白抗体与样本内总蛋白共孵育，形成复合物，纯化后凝胶电泳分离蛋白。然后直接采取液相色谱-质谱联用，对酶解后肽段进行质谱分析。通过计算质谱信号响应强度或谱图数目，获取与目的蛋白相互蛋白的定量信息。

图1. IP-MS技术流程

实验步骤

1、细胞样品获取、裂解：收集好细胞，加入 IP  Lysis 裂解液，4度摇匀裂解1小时，12000rpm，离心20min。取上清
2、Pre-IP：取lysate，加protein A/G-agarose , 4℃,温和混合1.5h。4℃，1000×g, 离心5min。
3、正式IP：Pre-IP所得上清平均分成两份，一份中加IP所用目的抗体10μg（10微升），另一份加等量Normal IgG对照抗体（10ug微升），4℃,温和旋转3h. 加入protein A/G-agarose ,4℃,8h. 1000×g, 离心5min, 沉淀用Buffer B洗一次，Buffer C洗两次，再用Buffer B洗一次。每次4℃混合20min, 1000×g, 离心5min。离心后,吸净洗涤buffer. 加2×loading buffer 水浴变性, 1000×g, 离心5min，吸上清上样进行SDS-PAGE电泳。之后进行Western blot检测，
5、考马斯亮蓝染色凝胶，将样本按多个馏分，解剖刀将胶带切成1-2mm大小的胶片放入小管中。加入脱色液浸泡，振荡10min，弃取溶液，重复1-2次直至蓝色褪尽。加入DTT还原液,30min,56度,弃废液,加200ul乙腈脱水5-10min，加入100ul碘乙酰胺烷基化，于暗处30min（开冻干机），加脱色液，洗5-10min，乙腈100ul,弃废液，用水和乙腈清洗3次。冰冻干燥20min.
6、加入50ul酶液，置于4度放置30min，待酶液完全被吸收，补充酶解缓冲液(25mMNH4HCO3)，使胶完全浸没，37度保温15小时以上或过夜。
7、加提取液I(5%TFA)100ul,40度加热水浴1小时，30min时，超声3min左右。                                                 
8、将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取II(50%乙腈，2.5%TFA)100ul,30度保温1小时，30min时，超声3min左右.
9、 将提取液合并，氮气吹干乙腈后，冰冻干燥。
10、加入5-10ul左右的0.1%TFA溶液混匀，质谱分析。