Co-IP -

CO-IP（免疫共沉淀）
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的ProteinA或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的原理开发出来的方法。其基本原理是，为了研究细胞中蛋白A与蛋白B是否结合，在细胞裂解液中加入抗蛋白A的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的ProteinA或G，若细胞中有与蛋白A结合的蛋白B，就可以形成这样一种复合物：“蛋白B—蛋白A—抗蛋白A抗体—agaroseProteinA或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。蛋白B然后经western blot或质谱检测目的蛋白。蛋白A这种方法得到的蛋白B是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。

图1. Co-IP技术流程

实验步骤
1、收集经过处理的细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30 min, 细胞裂解液于4°C，12000转离心30 min后取上清；
2、取少量裂解液以备免疫印迹分析，剩余裂解液中加入适量的相应抗体，4 °C缓慢摇晃孵育过夜；
3、取10μL protein A 或GAgarose珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3000 rpm离心3 min；
4、将预处理过的10 μl protein A 或G琼脂糖珠加入到经过与抗体孵育的细胞裂解液中，4 °C缓慢摇晃孵育2~4h，使抗体与protein A或GAgarose珠偶联；
5、免疫沉淀反应后，在4 °C以3000 rpm 速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1mL裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15 μL的3×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；
6、SDS-PAGE, 免疫印迹或质谱仪分析。

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