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技术原理
活细胞特别是增殖期细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT(即黄色噻唑兰)还原成难溶于水的蓝紫色针状Formazan结晶并沉淀在细胞中,且Formazan的形成量与细胞活力成正比,二甲基亚砜(DMSO)能够溶解Formazan结晶,用酶标仪在特定波长处测定其吸收值,即可间接反映细胞增殖情况。MTS及WST–8(CCK-8试剂)都是新型唑类化合物,和MTT一样,同样都能被细胞线粒体中的脱氢酶还原,MTS及WST–8被还原后的Formazan化合物具有高度水溶性,无需再用加DMSO,可直接用酶标仪在特定波长处测定吸收值。
因还原生成的甲臜物数量与活细胞的数量成正比,MTT、MTS、CCK-8均可用于细胞增殖的检测,目前被广泛应用于抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放敏感性测定等。
实验步骤
细胞收集——细胞铺板——(药物处理)——细胞培养0、24、48、72、96小时后加入MTT/MTS/CCK8处理——酶标仪检测

图1. CCK8检测细胞增殖结果分析示例
2. 平板克隆形成
待细胞形成单克隆后染色计数,通过计数克隆形成率,可对单个细胞的增殖潜力做定量分析,了解细胞的增殖能力和独立生存能力,平板克隆形成可用于检测贴壁细胞。实验步骤
铺板——细胞培养——观察克隆,染色——计算克隆形成率

图2. 克隆形成检测结果示例
3. 流式细胞周期检测
技术原理
细胞周期(cell cycle):是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程,通常由G0/G1期、S期、G2/M期组成。G0/G1期:二倍体细胞的DNA含量(2N)。S期:DNA开始合成,这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。G2/M期:DNA复制结束成为4倍体(4N)。
碘化丙啶(Propidium, PI)为插入性核酸荧光染料,能选择性的嵌入核酸DNA或RNA双链螺旋的碱基之间,产生红色荧光,并且荧光强度和所嵌入的核酸含量成正比。细胞周期检测时,首先用RNA 酶将RNA消化排除影响,通过流式细胞术检测PI荧光强度直接反映细胞各时相的DNA分布状态,从而计算出各时相的百分率。
实验步骤
细胞准备——样品收集——上机检测——数据分析

图3. 流式检测细胞周期结果示例
4. 流式细胞凋亡
细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自主结束其生命的过程。它是一个主动的,高度有序的,基因控制的,一系列酶参与的过程
实验步骤
细胞准备——收集细胞——Annexin-PE和 7-AAD进行双染色——流式上机检测

图4. 流式检测细胞凋亡结果分析示例
细胞运动性的研究,尤其是在肿瘤细胞的侵袭转移中应用很广泛。肿瘤转移是恶性肿瘤生物学特征之一,在肿瘤转移过程中的某些阶段,肿瘤细胞表现出较强的运动能力,如肿瘤细胞从原发瘤灶分离,进而侵入到邻近组织及再穿过血管壁进入血液循环和穿出血管壁进入继发部位等,因而细胞运动性的研究在弄清肿瘤细胞侵袭和转移的机制上有重要地位。
Transwell小室底层的一张有通透性的膜(一般为聚碳酸酯膜),将其放置于孔板中,小室内称上室,培养板内称下室。由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞。应用Transwell可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
肿瘤迁移实验:研究肿瘤细胞的迁移能力或特定情况下肿瘤细胞的迁移能力。常用8.0、12.0μm膜,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
肿瘤侵袭实验:研究肿瘤细胞的侵袭能力或特定情况下肿瘤细胞的侵袭能力。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶,模仿细胞外基质,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,细胞要把基质消化后才可以从上室迁移到下室,计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。
实验步骤
细胞复苏——Transwell铺板——细胞培养及染色——拍照
图5. 细胞迁移(左)和侵袭(右)检测结果分析示例
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