萤光素酶报告基因检测
   荧光素（luciferin）是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，其中最常见的荧光素酶有萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)和海肾荧光素酶(Rellina Luciferase)两类，在荧光素酶的催化下，荧光素底物可以高效的转变成氧荧光素，同时发出强烈的光。

   双荧光素酶报告基因检测系统由萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成。这两种酶的区别之一是他们的底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素和氧气。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的区别之二是发光的颜色不同：萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双报告实验中得到广泛应用，两种荧光素酶无需修饰，只要正常转录即具有活性，其中海肾荧光素酶作为转染的内参，来减少孔间细胞数量和转染效率对实验结果的影响，通过特定的荧光检测仪检测荧光量来判断酶的活性，进而反映基因间的关系。

图1.双荧光素酶检测流程

萤光素酶报告基因检测应用：
1、转录因子结合位点与启动子活性分析
2、miRNA靶基因验证
3、lncRNA吸附miRNA验证
4、circRNA吸附miRNA验证

转录因子结合位点与启动子活性分析
       转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。
       转录因子主要通过作用于靶基因的启动子起作用，将目的基因启动子区序列替换报告基因F-Luc的启动子，通过共表达转录因子后，报告基因表达的改变，来确定转录因子与靶基因启动子结合位点及对靶基因的作用。
目的基因质粒（pGL4.10-基因promotor）；对照质粒； pRL-CMV（E2261，Promega）；转录因子质粒；

microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因验证实验

   环状RNA(circRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)是一类非编码RNA,不翻译蛋白。但在细胞中它们能够调控其他基因的表达变化。近年的研究表明circRNA和lncRNA分子富含microRNA结合位点，在细胞中起到miRNA海绵（miRNA sponge）的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平，这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。因此，通过与疾病关联的miRNA相互作用，circRNA和lncRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。研究cirRNA、lncRNA的调控机制需要先找到与cirRNA、lncRNA相互作用的miRNA，而荧光素酶报告基因实验可以用来证明miRNA与circRNA, miRNA与lncRNA的直接相互作用

microRNA报告基因实验流程：
1.  microRNA靶点的预测
利用Targetscan,miRanda,PicTar软件得到目的microRNA的预测靶点序列。
2.  获得microRNA靶点序列
根据提供的靶序列，合成两条互补的单链DNA模板。或者，设计引物PCR扩增microRNA靶基因序列(lncRNA,circRNA全长序列或靶标序列)。
3.  cirRNA靶序列克隆
将合成的两条单链退火成双链（具有粘性末端），或将PCR产物双酶切，后连入经过同样双酶切的载体中，连接产物转化大肠杆菌DH5α。
4.  阳性克隆鉴定。
挑选转化的菌落，PCR筛选含有插入片段的阳性克隆，测序验证克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。
5.  细胞转染准备
将报告基因载体、microRNA mimics或microRNA negative control共转染293T或Hela细胞。
6.  荧光素酶检测
报告基因载体与microRNA mimics或microRNA negative control共转染293T细胞24-72h后，进行双荧光素酶检测，确定目的microRNA的靶基因。
7.  整理分析数据，得出结论。
提供有microRNA靶序列的报告基因质粒、甘油保存菌株各一支。附实验报告，包括载体构建过程，鉴定记录，测序报告，细胞转染，荧光检测。

图2.双荧光素酶案例分析（截短体研究的应用）